可視化完整活生物體內(nèi)的生物分子和細(xì)胞過(guò)程是化學(xué)生物學(xué)的主要目標(biāo)。然而，由于組織對(duì)光的散射，主要基于熒光發(fā)射的現(xiàn)有分子生物傳感器在這種情況下具有有限的用途。相比之下，超聲波可以輕松地以高時(shí)空分辨率對(duì)深部組織成像，但缺少將其對(duì)比度與特定生物分子(例如酶)的活性聯(lián)系起來(lái)所需的生物傳感器。
【科研摘要】
為了克服上述局限性，美國(guó)加州理工學(xué)院Mikhail G. Shapiro教授團(tuán)隊(duì)引入了第一個(gè)可遺傳編碼的聲學(xué)生物傳感器，即響應(yīng)蛋白酶活性而在超聲成像中“點(diǎn)亮”的分子。這些生物傳感器基于一類獨(dú)特的充氣蛋白質(zhì)納米結(jié)構(gòu)，稱為氣體囊泡(GVs)，作者將其設(shè)計(jì)為響應(yīng)三種不同蛋白酶的活性而產(chǎn)生非線性超聲信號(hào)。證明了這些生物傳感器能夠在體外，改造的益生菌內(nèi)部以及小鼠胃腸道體內(nèi)成像。相關(guān)成果以題為“Acoustic biosensors for ultrasound imaging of enzyme activity”發(fā)表在7月《Nature Chemical Biology》雜志上。
【圖文探討】
假設(shè)可以設(shè)計(jì)出基于GV的生物傳感器，這些傳感器可以根據(jù)特定生物分子的活性動(dòng)態(tài)改變其超聲對(duì)比度。這種可能性源自最近的發(fā)現(xiàn)，即GV的聲學(xué)特性可以在其組成蛋白的水平上得到修飾。特別是，位于GV表面(圖1)并提供結(jié)構(gòu)增強(qiáng)作用的支架蛋白氣囊泡蛋白C(GvpC)可以在其氨基酸序列水平進(jìn)行修飾，從而改變GV力學(xué)。
圖1：煙草蝕刻病毒(TEV)內(nèi)肽酶的聲學(xué)生物傳感器。
1.設(shè)計(jì)TEV內(nèi)肽酶的聲傳感器
為了檢測(cè)TEV的活性，作者設(shè)計(jì)了一個(gè)包含TEV識(shí)別基序ENLYFQ'G的GvpC變體(圖1b)，假設(shè)將GvpC切割成兩個(gè)較小的片段會(huì)導(dǎo)致GV殼變硬，從而使其屈曲并產(chǎn)生增強(qiáng)的非線性超聲對(duì)比度。確定了一種工程改造的GV變體，與活性TEV蛋白酶孵育后，其崩潰壓力中點(diǎn)降低了約70 kPa(圖 1c)。在GVSTEV上GvpC的TEV切割有望產(chǎn)生分子量分別約為9和14 kDa的N和C末端片段。確實(shí)，暴露于活性TEV后GVSTEV的凝膠電泳導(dǎo)致出現(xiàn)了兩個(gè)裂解的GvpC片段，并且完整的GvpC譜帶強(qiáng)度大大降低(圖1d)。此外，通過(guò)浮力純化GV從未結(jié)合片段的溶液中去除，導(dǎo)致N末端裂解片段的條帶強(qiáng)度降低，表明其在裂解后部分解離(圖1d)。與dTEV孵育后，未觀察到GvpC帶強(qiáng)度的顯著變化。透射電子顯微鏡(TEM)圖像顯示兩種條件下完整的GV具有相似的外觀，這證實(shí)蛋白酶切割不會(huì)影響下面的GV殼的結(jié)構(gòu)(圖1e)。動(dòng)態(tài)光散射(DLS)在與dTEV和活性TEV蛋白酶一起孵育后，工程GV的流體動(dòng)力學(xué)直徑?jīng)]有顯著差異，這證實(shí)了GV仍然分散在溶液中(圖1f)。
通過(guò)超聲對(duì)其進(jìn)行了成像。公開(kāi)GVSTEV樣品對(duì)TEV蛋白酶產(chǎn)生了很強(qiáng)的非線性聲響應(yīng)，在施加的438 kPa聲壓下，對(duì)比度噪聲比(CNR)增強(qiáng)了約7分貝(dB)(圖1g)。在暴露于dTEV的對(duì)照中，觀察到的非線性對(duì)比度明顯較低，而正如預(yù)期的那樣，兩個(gè)樣品均產(chǎn)生相似的線性散射。與GV殼的壓力相關(guān)力學(xué)一致，GVSTEV的微分非線性聲學(xué)響應(yīng)在高于295kPa的壓力下變得明顯，并一直保持增加到556 kPa，這時(shí)GV開(kāi)始坍塌(圖1h)
2. 設(shè)計(jì)鈣蛋白酶的聲學(xué)傳感器
在使用模型TEV蛋白酶驗(yàn)證了基本聲學(xué)生物傳感器設(shè)計(jì)后，作者檢查了其對(duì)其他內(nèi)肽酶的通用性。通過(guò)將源自α-血影蛋白的識(shí)別序列QQEVY’GMMPRD33插入到Ana GvpC中，作者設(shè)計(jì)了μ-鈣蛋白酶的聲學(xué)生物傳感器(圖2a)。在有或沒(méi)有鈣蛋白酶和Ca2+的緩沖液中進(jìn)行的加壓吸收光譜使能夠確定鈣蛋白酶的GV傳感器(GVScalp)，顯示在存在酶及其離子活化劑的情況下靜水壓塌壓力降低了約50 kPa(圖2b)。
圖2：鈣激活鈣蛋白酶蛋白酶的聲學(xué)生物傳感器。
3. 建立蛋白酶ClpXP的聲音傳感器
除了內(nèi)肽酶，參與細(xì)胞蛋白質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)和體內(nèi)平衡的另一類重要酶是過(guò)程性蛋白酶，其從其末端開(kāi)始展開(kāi)并降解完整的蛋白質(zhì)。為了確定是否可以針對(duì)此類酶開(kāi)發(fā)基于GV的生物傳感器，作者選擇了ClpXP，這是一種來(lái)自大腸桿菌的過(guò)程性蛋白水解復(fù)合物，包含解折疊酶ClpX和肽酶ClpP。ClpX識(shí)別并展開(kāi)包含稱為degrons的特定末端肽序列的蛋白質(zhì)底物。然后將未折疊的蛋白質(zhì)送入ClpP，后者將它們降解為小肽片段。假設(shè)在GvpC的C末端添加一個(gè)degron將使ClpXP識(shí)別并降解該蛋白，同時(shí)保留完整的基礎(chǔ)GvpA外殼，從而使GV具有更大的機(jī)械柔韌性和非線性超聲對(duì)比(圖3a)。
圖3：ClpXP蛋白酶的聲學(xué)生物傳感器。
4. 構(gòu)建細(xì)胞內(nèi)聲學(xué)傳感器基因
在演示了聲學(xué)生物傳感器的體外性能后，作者努力證明它們可以對(duì)活細(xì)胞內(nèi)部的酶活性作出反應(yīng)。作為細(xì)胞宿主，選擇了大腸桿菌Nissle 1917菌株。該大腸桿菌的益生菌菌株可以在哺乳動(dòng)物胃腸道中定殖，被廣泛用作微生物治療劑開(kāi)發(fā)的基礎(chǔ)，使其成為細(xì)胞內(nèi)生物傳感器的重要平臺(tái)。為了開(kāi)發(fā)針對(duì)ClpXP(ASGClpXP)的細(xì)胞內(nèi)聲學(xué)傳感器基因(ASG)，作者將ARG基因簇(ARGWT)中的WT gvpC與可降解GVSClpXP的修飾gvpC進(jìn)行了交換(圖4a)。
接下來(lái)，為了檢查ASGClpXP以動(dòng)態(tài)方式響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)酶活性的能力，作者通過(guò)基因組敲除編碼ClpX和ClpP的基因，生成了一個(gè)Nissle細(xì)胞(ΔclpXP)，并創(chuàng)建了包含這兩個(gè)質(zhì)粒的質(zhì)?；?圖4a)。這能夠從外部控制ClpXP酶的活性。ΔclpXP Nissle細(xì)胞與可誘導(dǎo)的clpX-clpP(clpXP)質(zhì)粒和ASGClpXP共轉(zhuǎn)化。用L-arabinose誘導(dǎo)后，這些細(xì)胞中ClpXP的產(chǎn)生導(dǎo)致靜水壓塌點(diǎn)中點(diǎn)降低約160 kPa(圖4b)。在超聲成像下，與未誘導(dǎo)該蛋白酶的細(xì)胞相比，具有誘導(dǎo)的ClpXP活性的細(xì)胞顯示出明顯更強(qiáng)的非線性對(duì)比度(+6.7 dB)(圖4c)，同時(shí)顯示出類似的B型信號(hào)。在高于950 kPa的聲壓下，可以檢測(cè)到非線性信號(hào)增強(qiáng)(圖4d)。這些實(shí)驗(yàn)證明了ASGClpXP能夠充當(dāng)細(xì)胞內(nèi)聲學(xué)傳感器來(lái)監(jiān)測(cè)可變酶活性的能力。
圖4：監(jiān)測(cè)工程細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)蛋白酶活性和電路驅(qū)動(dòng)的基因表達(dá)。
5. 體內(nèi)細(xì)胞內(nèi)ClpXP活性超聲成像
在建立體外聲學(xué)生物傳感器工程的基本原理并證明其在活細(xì)胞中的性能后，作者評(píng)估了傳感器構(gòu)建體在體內(nèi)生物學(xué)相關(guān)解剖位置內(nèi)產(chǎn)生超聲對(duì)比的能力。由于胃腸道在動(dòng)物體內(nèi)的位置相對(duì)較深，并且在臨床診斷和胃腸道病理動(dòng)物模型中使用超聲，并采取了適當(dāng)?shù)拇胧┮猿潭鹊販p少氣泡和固體物質(zhì)的潛在干擾，因此胃腸道也是超聲成像的極佳目標(biāo)。
為了證明聲學(xué)生物傳感器在小鼠胃腸道的體內(nèi)環(huán)境中產(chǎn)生非線性超聲對(duì)比的能力，首先將表達(dá)ASGClpXP和ARGWT的WT Nissle細(xì)胞共注射到小鼠結(jié)腸中。沿管腔壁的細(xì)胞群，另一個(gè)位于管腔中心。將細(xì)胞通過(guò)直腸注射的瓊脂糖水凝膠引入結(jié)腸，以實(shí)現(xiàn)精確定位和控制組成。使用非線性超聲成像，可以清楚地將蛋白酶敏感ASG產(chǎn)生的獨(dú)特對(duì)比度可視化為襯在結(jié)腸周圍的明亮對(duì)比環(huán)(圖5a)。使用來(lái)自換能器的高壓脈沖，在GV聲塌陷之前和之后采集的超聲圖像進(jìn)行比較，確認(rèn)非線性對(duì)比度的亮環(huán)是來(lái)自表達(dá)ASGClpXP的細(xì)胞(圖5a)。在九只小鼠的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，該結(jié)果是一致的(圖5b)。
為了證明酶活性的體內(nèi)成像，作者將表達(dá)ASGClpXP的ΔclpXP Nissle細(xì)胞引入小鼠結(jié)腸中，無(wú)論是否轉(zhuǎn)錄激活細(xì)胞內(nèi)ClpXP(示意圖均顯示在圖6中)。如前所述，細(xì)胞被包含在瓊脂糖水凝膠中。與不表達(dá)ClpXP的細(xì)胞相比，誘導(dǎo)表達(dá)該酶的細(xì)胞顯示出增強(qiáng)的非線性對(duì)比(圖5c)。聲塌陷證實(shí)了聲生物傳感器是非線性信號(hào)的主要來(lái)源(圖5c)。該性能在七只小鼠和細(xì)胞的兩個(gè)空間排列中是一致的(圖5d)。這些結(jié)果證明了聲學(xué)生物傳感器在體內(nèi)成像的背景下可視化酶活性的能力。
圖5：在小鼠胃腸道中表達(dá)ASG的細(xì)菌的超聲成像。
【陳述總結(jié)】
該結(jié)果建立了用超聲成像無(wú)創(chuàng)地觀察蛋白酶活性的范例。該研究有助于未來(lái)的大量研究，以將聲蛋白酶?jìng)鞲衅鞯膽?yīng)用范圍擴(kuò)展到本研究所示的概念驗(yàn)證演示之外。而在大腸桿菌中的實(shí)驗(yàn)并且在小鼠胃腸道內(nèi)建立了這種生物傳感器在相關(guān)生物學(xué)環(huán)境中產(chǎn)生超聲對(duì)比的關(guān)鍵能力，其他以應(yīng)用程序?yàn)橹行牡膬?yōu)化將使這些構(gòu)建物能夠用于解決基礎(chǔ)生物學(xué)和合成生物學(xué)中的特定問(wèn)題。同時(shí)，存在很大的空間用于進(jìn)一步優(yōu)化和推廣聲學(xué)生物傳感器的設(shè)計(jì)。
重慶分公司
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