這期內(nèi)容當(dāng)中小編將會給大家?guī)碛嘘P(guān)怎么使用ballgown進行轉(zhuǎn)錄本水平的差異分析，文章內(nèi)容豐富且以專業(yè)的角度為大家分析和敘述，閱讀完這篇文章希望大家可以有所收獲。

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常見的轉(zhuǎn)錄組差異分析有兩種策略，一種是基于raw count的定量方式，比如DESeq2, edgeR等；另外一種是基于FPKM/RPKM的定量方式，比如cuffdiff等。

在之前的文章中，我們也提到過基于FPKM值的pipeline由tophat+cufflinks+cuffdiff 升級更新為hisat + stringTie + ballgown。ballgown這個R包也是針對FPKM值的表達量進行差異分析，有兩種方式可以得到轉(zhuǎn)錄本水平的FPKM值。

1. stringTie

為了方便下游的ballgown分析，在stringTie軟件中直接添加-b參數(shù)就可以生成ballgown的輸入文件，基本用法如下

stringtie -p 10 \
-G hg19.gtf \
-o output.gtf  \
-b ballgown_out_dir -e \
align.sorted.bam

2. tablemaker

tablemaker軟件通過調(diào)用cufflinks軟件，也可以生成ballgown的輸入文件，該軟件可以從以下鏈接下載

https://figshare.com/articles/Tablemaker_Linux_Binary/1053137

基本用法如下

tablemaker \
-p 4 \
-q -W \
-G hg19.gtf \
-o out_dir \
align.sorted.bam

對于每個樣本，都會生成一個文件夾，包含如下5個文件

e_data.ctab
e2t.ctab
i2t.ctab
i_data.ctab
t_data.ctab

e代表exon, i代表intron, t代表transcript，_data的文件為不同水平的表達量值。i2t表示intron和transcript之間的對應(yīng)關(guān)系，e2t表示exon和transcript的對應(yīng)關(guān)系。

輸入文件準(zhǔn)備好之后，就可以進行差異分析了?，F(xiàn)在的R包都是高度封裝的，幾個函數(shù)就可以完成整套分析了。首先是讀取所有樣本的輸入文件，代碼如下

library(ballgown)
bg = ballgown(
  samples = c("sampleA.dir", "sampleB.dir")，
  meas='all')

samples 指定所有樣本的ballgown的輸入文件夾。導(dǎo)入成功之后，可以通過*expr函數(shù)在R中查看樣本在不同水平的表達量信息， *的取值范圍為i, e, t， g，代表不同水平。

查看轉(zhuǎn)錄本水平的表達量的代碼示例如下

transcript_fpkm = texpr(bg, 'FPKM')

需要注意的是，intron, exon, transcript 這些水平的表達量信息在原本的ctab文件中都有，而gene水平的表達量信息，需要根據(jù)基因?qū)?yīng)的轉(zhuǎn)錄本的表達量來計算，所以比較費時。

讀取之后，需要設(shè)置樣本分組, 代碼如下

pData(bg) <- data.frame(
  id=sampleNames(bg),
  group=rep(c(1,0), each=3)
)

其實就是一個數(shù)據(jù)框，第一列為樣本名稱，第二列為樣本對應(yīng)的分組。

ballgown會自動根據(jù)group的種類進行不同類型的差異分析，如果樣本分為兩組，則進行兩組間的差異分析，如果樣本為多組，則進行多組間的差異分析。

ballgown通過stattest函數(shù)進行差異分析，支持以下4種水平的差異分析

1. exon

2. intron

3. gene

4. transcript

通過feature參數(shù)指定差異分析的水平。常規(guī)用法如下

# 轉(zhuǎn)錄本水平的差異分析
stat_results = stattest(bg,
  feature='transcript',
  meas='FPKM',
  covariate='group')

# 基因水平的差異分析
stat_results = stattest(bg,
  feature='gene',
  meas='FPKM',
  covariate='group')

ballgown還支持時間序列的差異分析，用法如下

pData(bg) <- data.frame(
  pData(bg),
  time=rep(1:10, 2)
)

results <- stattest(bg,
  feature='transcript',
  meas='FPKM',
  covariate='time',
  timecourse=TRUE
)

只需要添加timecourse=TRUE即可。ballgown還支持自定義差異分析的模型。

上述就是小編為大家分享的怎么使用ballgown進行轉(zhuǎn)錄本水平的差異分析了，如果剛好有類似的疑惑，不妨參照上述分析進行理解。如果想知道更多相關(guān)知識，歡迎關(guān)注創(chuàng)新互聯(lián)行業(yè)資訊頻道。