如何使用MISO進(jìn)行可變剪切的分析，很多新手對(duì)此不是很清楚，為了幫助大家解決這個(gè)難題，下面小編將為大家詳細(xì)講解，有這方面需求的人可以來學(xué)習(xí)下，希望你能有所收獲。
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MISO是一款經(jīng)典的可變剪切分析工具，和rmats類似，該軟件也支持對(duì)可變剪切事件進(jìn)行定量和差異分析。
這個(gè)軟件支持exon和transcript兩種水平的可變剪切分析，在rmats的文章中，我們也提到了rmats是從exon水平給出的可變剪切結(jié)果，因?yàn)槎鷾y(cè)序讀長(zhǎng)短的特點(diǎn)，無法有效得到轉(zhuǎn)錄本全長(zhǎng)，從exon水平得到的結(jié)果更加的準(zhǔn)確，而且陽性結(jié)果更容易通過RT-PCR驗(yàn)證出來，但是無法詳細(xì)的探究某個(gè)基因不同isoform之間的變化；transcript水平直接給出不同isoform間的定量和差異，能有效的探究基因不同isofrm的變化情況，但是結(jié)果準(zhǔn)確性較差。
該軟件是一個(gè)python包，直接通過pip就可以安裝，分析的pipeline如下
對(duì)于transcript水平的分析而言，只需要提供轉(zhuǎn)錄本的GFF文件，可以從Ensembl等數(shù)據(jù)庫(kù)下載參考基因組的gtf文件，然后自己轉(zhuǎn)換成GFF3格式；對(duì)于exon水平而言，需要提供已知的可變剪切事件的GFF格式文件，示意如下
chr1 SE gene 4772649 4775821 . - . ID=chr1:4775654:4775821:-@chr1:4774032:4774186:-@chr1:4772649:4772814:-;Name=chr1:4775654:4775821:-@chr1:4774032:4774186:-@chr1:4772649:4772814:- chr1 SE mRNA 4772649 4775821 . - . ID=chr1:4775654:4775821:-@chr1:4774032:4774186:-@chr1:4772649:4772814:-.A;Parent=chr1:4775654:4775821:-@chr1:4774032:4774186:-@chr1:4772649:4772814:- chr1 SE mRNA 4772649 4775821 . - . ID=chr1:4775654:4775821:-@chr1:4774032:4774186:-@chr1:4772649:4772814:-.B;Parent=chr1:4775654:4775821:-@chr1:4774032:4774186:-@chr1:4772649:4772814:- chr1 SE exon 4775654 4775821 . - . ID=chr1:4775654:4775821:-@chr1:4774032:4774186:-@chr1:4772649:4772814:-.A.up;Parent=chr1:4775654:4775821:-@chr1:4774032:4774186:-@chr1:4772649:4772814:-.A chr1 SE exon 4774032 4774186 . - . ID=chr1:4775654:4775821:-@chr1:4774032:4774186:-@chr1:4772649:4772814:-.A.se;Parent=chr1:4775654:4775821:-@chr1:4774032:4774186:-@chr1:4772649:4772814:-.A chr1 SE exon 4772649 4772814 . - . ID=chr1:4775654:4775821:-@chr1:4774032:4774186:-@chr1:4772649:4772814:-.A.dn;Parent=chr1:4775654:4775821:-@chr1:4774032:4774186:-@chr1:4772649:4772814:-.A chr1 SE exon 4775654 4775821 . - . ID=chr1:4775654:4775821:-@chr1:4774032:4774186:-@chr1:4772649:4772814:-.B.up;Parent=chr1:4775654:4775821:-@chr1:4774032:4774186:-@chr1:4772649:4772814:-.B chr1 SE exon 4772649 4772814 . - . ID=chr1:4775654:4775821:-@chr1:4774032:4774186:-@chr1:4772649:4772814:-.B.dn;Parent=chr1:4775654:4775821:-@chr1:4774032:4774186:-@chr1:4772649:4772814:-.B
第二列表示可變剪切的類型，以外顯子跳躍為例，ID的格式如下
chr1:4775654:4775821:-@chr1:4774032:4774186:@chr1:4772649:4772814
包含了用@符號(hào)隔開的3個(gè)外顯子，中間的exon的跳過的外顯子，第一個(gè)為上游的外顯子，第二個(gè)為下游的外顯子，對(duì)應(yīng)如下示意圖中的3個(gè)exon
transcript水平的GFF文件從數(shù)據(jù)庫(kù)中下載即可，而exon水平的GFF文件是需要自己先識(shí)別可變剪切的不同isoform,然后整理得到的，對(duì)于人和小鼠等常見物種，官網(wǎng)提供了exon水平的GFF文件，鏈接如下
https://miso.readthedocs.io/en/fastmiso/annotation.html
準(zhǔn)備好GFF文件之后，就可以建立索引了，命令如下
index_gff --index ensGene.gff3 index_db
index_db為索引保存的目錄。
運(yùn)行miso需要第一步建好的索引以及樣本對(duì)應(yīng)的bam文件，該bam文件必須是經(jīng)過排序處理的，而且有對(duì)應(yīng)的bai索引，對(duì)于雙端數(shù)據(jù)，用法如下
miso --run index_db \ algin.sorted.bam \ --output-dir out_dir \ --read-len 150 \ --paired-end 250 15 \ --settings-filename miso_settings.txt
read-len是reads的平均長(zhǎng)度，paired-end代表插入片段長(zhǎng)度的平均值和方差，miso_settings.txt是配置文件，內(nèi)容如下
[data] filter_results = True min_event_reads = 20 strand = fr-unstranded [sampler] burn_in = 500 lag = 10 num_iters = 5000 num_processors = 4
配置文件中的參數(shù)很多，就不一一解釋了，每個(gè)參數(shù)的意義請(qǐng)參考官方文檔。
通過上述方式得到的結(jié)果可以直接用于后續(xù)的差異分析，但是這個(gè)結(jié)果不利于我們查看，所以官方提供了匯總程序，用法如下
summarize_miso \ --summarize-samples \ raw_out/ \ summary_out1
進(jìn)行樣本間差異分析的代碼如下
compare_miso --compare-samples control case/ comparisons/
在輸出目錄，會(huì)生成一個(gè)后綴為bf的文件。
用法如下
filter_events \ --filter case_vs_control.miso_bf \ --num-inc 1 \ --num-exc 1 \ --num-sum-inc-exc 10 \ --delta-psi 0.20 \ --bayes-factor 10 \ --output-dir filter_dir
用法如下
sashimi_plot \ --plot-event "chr1:7778:7924:-@chr1:7096:7605:-@chr1:6717:6918:-" \ index_db/ \ sashimi_plot_settings.txt \ --output-dir out_dir
sashimi_plot_settings.txt是配置文件，其中設(shè)置了樣本的bam文件和可變剪切的輸出結(jié)果，示例如下
[data] # directory where BAM files are bam_prefix = ./test-data/bam-data/ # directory where MISO output is miso_prefix = ./test-data/miso-data/ bam_files = [ "heartWT1.sorted.bam", "heartWT2.sorted.bam", "heartKOa.sorted.bam", "heartKOb.sorted.bam"] miso_files = [ "heartWT1", "heartWT2", "heartKOa", "heartKOb"] [plotting] # Dimensions of figure to be plotted (in inches) fig_width = 7 fig_height = 5 # Factor to scale down introns and exons by intron_scale = 30 exon_scale = 4 # Whether to use a log scale or not when plotting logged = False font_size = 6 # Max y-axis ymax = 150 # Whether to plot posterior distributions inferred by MISO show_posteriors = True # Whether to show posterior distributions as bar summaries bar_posteriors = False # Whether to plot the number of reads in each junction number_junctions = True resolution = .5 posterior_bins = 40 gene_posterior_ratio = 5 # List of colors for read denisites of each sample colors = [ "#CC0011", "#CC0011", "#FF8800", "#FF8800"] # Number of mapped reads in each sample # (Used to normalize the read density for RPKM calculation) coverages = [ 6830944, 14039751, 4449737, 6720151] # Bar color for Bayes factor distribution # plots (--plot-bf-dist) # Paint them blue bar_color = "b" # Bayes factors thresholds to use for --plot-bf-dist bf_thresholds = [0, 1, 2, 5, 10, 20]
最終會(huì)產(chǎn)生如下所示的結(jié)果
這種圖稱之為sashimi plot , 是一種專用于可變剪切可視化的圖表，上述示意圖表示的是一個(gè)外顯子跳躍事件在不同樣本中的表達(dá)情況，左下方是GFF文件中共的exon結(jié)構(gòu)，左上方是每個(gè)樣本中比對(duì)上exon的reads的可視化，采用了RPKM表示，不同剪切方式用曲線鏈接，曲線上標(biāo)記的是比對(duì)上該區(qū)域的reads數(shù)目，不同分組的樣本用不同顏色表示，右側(cè)的圖片是樣本中對(duì)應(yīng)的可變剪切的表達(dá)量值。
從這種圖中，可以直觀的看到兩組樣本間的可變剪切表達(dá)有無差異，上圖中heartWT組中的表達(dá)量高于heartKO組。
實(shí)際分析時(shí)，由于需要手動(dòng)整理可變剪切isofrom對(duì)應(yīng)的gff文件，所以使用的難度較大，但是其提供的可視化功能是非常值得借鑒的。
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